酶切法原理？

一、酶切法原理？

酶切法是一种常用的分子生物学实验技术，用于将DNA分子在特定的位置进行切割。该方法利用特定的酶（如限制性内切酶）识别目标DNA序列，并在该序列的特定位点引起断裂。酶切法的原理是基于酶与DNA序列的互作用，酶能够识别并结合到特定的DNA序列中。在酶切反应中，当酶与目标DNA序列匹配时，酶会识别并结合到该序列上，并在特定的酶切位点引发切割，将DNA分子在该位置切成两段。酶切法的原理基于DNA的序列特征和酶的识别性，使得科学家可以对DNA进行特定的切割和拼接，进而开展各类基因组学研究和遗传工程实验。这种实验方法广泛应用于基因克隆、限制性地位多态性（RFLP）分析、基因突变分析等领域。通过酶切法，科学家可以对DNA进行特定的修饰和操作，从而揭示和理解生命的基因遗传信息。

二、酶切的原理？

酶切法原理：

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。可分为三类：

Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。

Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，其修饰同一识别序列。

Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5'-G↓AATTC-3'），有少数酶识别更长的序列或简并序列。

Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：5'-CCC↓GGG-3'）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称黏性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的黏性末端。

三、外切酶和内切酶的区别？

外切酶和内切酶是两种不同类型的限制性核酸内切酶，它们的主要区别在于它们在扫描二进制DNA序列时切割DNA的位置不同。

外切酶会在识别到目标DNA序列后，将酶切割并释放出来，切割点在目标DNA序列的外侧，即该序列的外侧。这种酶切割模式会产生两个或更多的线性DNA分子。

相反，内切酶会通过切割位点“内侧”来切割目标DNA序列。它会将目标DNA序列切成两段，并在目标DNA序列内部形成粘性的末端。利用多种内切酶在不同的位点进行切割，可以生成具有不同的粘性末端的DNA分子。

总的来说，外切酶和内切酶在切割DNA时的位置和方式不同，这种不同导致了碎片的长度和其他特性的不同，差异也符合不同的实验需求。

四、限制酶和内切酶的区别？

区别：含义不同，作用不同。

一、含义不同：

核酸内切酶：在核酸水解酶中，为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶，与核酸外切酶相对应。

核酸外切酶： 核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。

二、作用不同：

核酸外切酶的作用：从核酸链的一端逐个水解下核苷酸。限制性核酸内切酶的作用：识别特定的核苷酸序列，并在DNA分子内部的一定位点切割DNA 。

核酸内切酶：大都不具碱基特异性，但也有诸如脾脏RNase、RNaseT1等或限制性内切酶那种能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶。

五、内切酶有几种？

内切酶主要分成三大类。（可以有多种）

①第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。

②第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。

③第三类内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。

六、内切酶和连接酶的异同？

解旋酶：催化解旋DNA双链——DNA复制的前解旋的时候用

DNA聚合酶：将四种脱氧核苷酸催化合成DNA——DNA复制过程中用

RNA聚合酶：将四种核糖核苷酸催化合成RNA——RNA合成过程中用

限制性核酸内切酶：将一条DNA双链切割成两条DNA双链——基因工程中剪切DNA时用

DNA连接酶：将两条粘性末端碱基互补的DNA双链连接成一条长DNA双链——将目的基因与载体结合时用

七、PCR产物和质粒双酶切后电泳如何判断酶切完成？

提出来的质粒进行电泳实验。

提出来的质粒酶切后跑电泳。

有些时候，长出来的菌落不好说里面有没有质粒或者有什么质粒，特别是这种菌落长得不多的时候。至少在PCR之前可以进行1和2检测有没有质粒以及有没有插入片段。

八、内切酶和外切酶的定义是什么？

两者同属核酸酶,只是切割核酸的方式不一样而已。凡能从多核苷酸链的末端开始水解核酸的酶称为核酸外切酶，凡能从多核苷酸链中间开始水解核酸的酶称为核酸内切酶。而能识别特定的核苷酸顺序,并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶(限制酶）。

九、酶切反应的操作步骤？

冰上操作，充分混匀，控制用量，控制反应时间

冰上操作：使用过程中注意对酶的保护，以免失活

充分混匀：充分混匀才能使酶充分发挥作用

控制用量：过多的酶会导致星活性（比如用限制性内切酶的酶切实验），即酶切错误；PCR中酶加得过多也容易导致非特异扩增

控制反应时间：根据具体的酶、具体的实验确定相应的反应时间

十、双酶切的基本过程？

做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来。

我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干；对照的设立：为验证双酶切是否成功。